(Biologija, Biohemija, Matematika) POMOC-kvantifikacija western-a

[gost 39034]

koji softverski sistem koristite za kvantifikaciju western-a? da li pulujete proteine iz vise razlicitih zivotinja? koju statistiku u tom slucaju koristite?

 

[endonuclease]

koji softverski sistem koristite za kvantifikaciju western-a? da li pulujete proteine iz vise razlicitih zivotinja? koju statistiku u tom slucaju koristite?

ImageQuant je dobar, koristio sam ga za westerne, binding assays, kao i za kvantifikaciju DNK na EtBr gelovima. Trenutno koristim Quantity One, koji se meni čini mnogo nezgrapnijim, ali nemam mnogo izbora (odeljenje je pljunulo pare za BioRad imaging sistem, i sada insistira na njegovom korišćenju, sve sa standardnim softverom).

Statistika zavisi od potrebe. Da li porediš proseke uzoraka (prosek iz x kontrolnih životinja poređen sa prosekom od x životinja test grupe), ili porediš svaki uzorak sa svim drugim?

 

[Paganko]

Doooobro.... Zamislicu da nikad nisam upao na ovu temu i procitao pitanje. A onda i odgovor.....

 

[endonuclease]

Doooobro.... Zamislicu da nikad nisam upao na ovu temu i procitao pitanje. A onda i odgovor.....

Eh, u stvari ti bi mogao ovde da nam matematički objasniš par stvari.

Ajde da objasnimo čime se bavi ova tema.

Šta je to Western Blot?

Western blot je način da se a) detektuje prisustvo nekog proteina, i b) kvantifikuje količina tog proteina u nekom tkivu ili grupi ćelija.

Princip je relativno jednostavan. Uzmeš i razbiješ gomilu ćelija (ovo mogu biti bakterije, ili čitava životinja veličine mušice, ili neki isečeni deo tkiva), i homogenizuješ smesu koja time rezultuje.

Onda ove proteine razdvojiš - skoro uvek pomoću tehnike poznate kao SDS-PAGE. Ova nezgrapna skraćenica je ime tehnike u kojoj napraviš tanak gel od poliakrilamida: zamisli nešto što je po konzisteniciji između plastike i pudinga, i imaćeš generalnu ideju. Na molekularnom nivou, ovaj gel izgleda kao trodimenzonalna spetljana mreža.

U mešavinu proteina koje si dobio dodaš jedan detrdžent, natrijum dodecil sulfat, koji proteine ispravi u pravu liniju i učini ih negagtivno naelektrisanim. Ovu smesu staviš na vrh ovog gela, i pustiš električni gradijent preko njega.

Pošto su proteini sada negativno naelektrisani, oni će biti privučeni prema pozitivnoj elektrodi. Ali da bi se kretali prema njoj, oni moraju da se provuku kroz mrežu. Otud, manji proteini će se brže provući, a veći sporije. Ovo rezultuje u razdvajanju proteina po veličini.

Rezultat izgleda otprilike ovako:

Sa leve strane je standardna mešavina proteina, čije težine (merene u kilodaltonima) su poznate. U desnim kolonama su uzorci. Proteini se razdvajaju u linije, po dužini: najlakši i najmanji proteini su na dnu, najteži i najduži su na vrhu gela.

E, sad...koji od ovih je onaj tvoj? I koliko ga u stvari precizno ima?

Da bi ovo utvrdio, potrebno je još posla.

Staviš svoj gel pored nitrocelulozne membrane, i ovo staviš u sendvič između anode i katode. Opet pustiš struju. Protein se prenosi iz matrice gela prema nitrocelulozi - koja veoma snažno vezuje proteine na svojoj površini. Kao rezultat, dobijaš prazan gel, i parče nitroceluloznog papira na kome se nalaze tvoji proteini.

Potopiš taj papir u nešto bogato nekim neutralnim proteinima (recimo, mleko). Sada imaš papir na kome su (nevidljivo) vezani razni proteini sa tvog gela, a cela ostala površina je prekrivena proteinima iz mleka.

Onda ovaj papir izložiš antitelu protiv tvog proteina. Antitelo se veže za protein. Onda opet ovo izložiš drugom antitelu - ovaj put protiv prvog antitela (razlozi za dvostruko antitelo su suviše velika digresija od osnovne priče). Ovo drugo antitelo je vezano za neki enzim, ili neki signalni sistem.

Kao rezultat, dobijaš parče papira na kome se nalaze svi proteini kao i na gelu, ali samo onaj tvoj protein (u idealnom slučaju) sadrži signal koga proizvode antitela. Rezultat izgleda otprilike ovako:

Na osnovu ovoga ti znaš da zaista imaš onaj protein koga misliš da imaš, a na osnovu snage signala možeš da uporediš koliko ga imaš.

Evo kako izgleda originalni SDS-PAGE gel, pored svog sopstvenog Western blota:

Na levoj strani gomila proteina, na desnoj vidiš samo jedan - onaj koji je reagovao sa antitelom.

Ovo je strahovito korisna tehnika. Pomoću nje, recimo, možeš da pratiš kakve molekularne efekte imaju tretmani, ili povrede, ili određene situacije... Recimo, možeš da daš životinji nešto, i uzimaš uzorke svakih nekoliko sati, i gledaš nivo proteina:

Nadam se da ovo goreopisano ima smisla.

Statistička analiza

Drugi deo pitanja koje je malavelika postavila je, zapravo, bliska tvojoj oblasti, Paganko.

Pitanje je kako statistički analizirati podatke koje dobiješ Westernom iz više životinja. A odgovor koga sam ja dao (sa mojim znanjem, koje je bazirano na jednom datom ispitu iz osnovne statistike) je sledeći:

- ako se radi o poređenju proseka, koristi se studentov t-test. Dakle, ako sam izmerio nivo proteina u pet kontrolnih životinja, i uzeo prosek; pa sam onda isto uradio u pet životinja koje su primile neku intervenciju, i uzeo odatle prosek; dobijam dva broja, koja poredim pomoću t-testa.

- ako se radi o poređenju više životinja nezavisno, ANOVA.

Kako i zašto, i da li ovde ima problema, to bi ti mogao da objasniš mnogo bolje nego ja.

 

[gost 39034]

ImageQuant je dobar, koristio sam ga za westerne, binding assays, kao i za kvantifikaciju DNK na EtBr gelovima. Trenutno koristim Quantity One, koji se meni čini mnogo nezgrapnijim, ali nemam mnogo izbora (odeljenje je pljunulo pare za BioRad imaging sistem, i sada insistira na njegovom korišćenju, sve sa standardnim softverom).

Statistika zavisi od potrebe. Da li porediš proseke uzoraka (prosek iz x kontrolnih životinja poređen sa prosekom od x životinja test grupe), ili porediš svaki uzorak sa svim drugim?

ja koristila za PCR Multi-Analyst/PC Software Image Analysis System (Bio-Rad) ali mi ne ne odgovara za western...a, i za PCR, 'fala Bogu sto sam presla na Real Time
za western koristim Image Quant, ver. 5.2 od Amersham-a, ali nisam zadovoljna...kad je hemiluminiscencija OK, ali za skenirane filmove mi daje tako nereproducibilne rezultate, i nikako da doteram background...uzas...
a, pulovani uzorci su mi iz vise ziviotinja, koje cine jednu ekspreimentalnu grupu
medjutim, blotovi se toliko medju sobom razlikuju, da onda svaku grupu, kad svedem na house-keeping gen, moram da svedem i na kontrolnu, koja mi onda, jelte, postaje 100%, te iz pet blotova imam pet jedinica za kontrolu, i pet brojki za eksp. grupu, sto mi onemogucava da radim ANOVU, vec moram na neparametrijsku statistiku, najcesce Mann–Whitney’s U-test, sto me nervira...nekako ne verujem tim rezultatima ..

 

[gost 39034]

Doooobro.... Zamislicu da nikad nisam upao na ovu temu i procitao pitanje. A onda i odgovor.....

jao, sto volim ovakve odgovore...ne samo da ne pomognu (iako u naslovu teme jasno stoji pomoc), vec udju na temu samo da zarolaju ocima malo...

 

[endonuclease]

za western koristim Image Quant, ver. 5.2 od Amersham-a, ali nisam zadovoljna...kad je hemiluminiscencija OK, ali za skenirane filmove mi daje tako nereproducibilne rezultate, i nikako da doteram background...uzas...

Ovo više vuče ka metodologiji Westerna nego ka problemima sa softverom. Ako rešiš osnovnu stvar, neće biti potrebna ni komplikovana statistika.

Prvo, background, čime blokiraš? Ja sam svojevremeno uspevao da značajno smanjim background korišćenjem 3-5% BSA (čista frakcija IV) umesto mleka. Takođe, očigledne stvari tipa smanjiti koncentraciju primarnog i/ili sekundarnog AB (u jednom slučaju, jedini reproducibilan rezultat sam mogao da dobijem sa količinom AB sto puta manjom od minimalne preporučene u literaturi).

Drugo, skenirani filmovi - čime skeniraš? Laserski skeneri mogu da rade, ali standardni skeneri unose ogromnu količinu varijacije (u zavinosti od položaja tačke na filmu u odnosu na izvor svetlosti, i u zavisnosti od lokalne varijacije kvaliteta u prijemniku).

Takođe, zašto koristiš filmove uopšte? Mislim, ok, za dokumentaciju, ali direktno merenje je odavno prešlo na druge metode, bar u mom domenu. Hemiluminiscencija se meri direktno, a aktivnost radioizotopa pomoću fosforescentnih listova koji se posle skeniraju laserom (Typhoon, Storm, i slične mašinice).

 

[Paganko]

Statistička analiza

Drugi deo pitanja koje je malavelika postavila je, zapravo, bliska tvojoj oblasti, Paganko.

Pitanje je kako statistički analizirati podatke koje dobiješ Westernom iz više životinja. A odgovor koga sam ja dao (sa mojim znanjem, koje je bazirano na jednom datom ispitu iz osnovne statistike) je sledeći:

- ako se radi o poređenju proseka, koristi se studentov t-test. Dakle, ako sam izmerio nivo proteina u pet kontrolnih životinja, i uzeo prosek; pa sam onda isto uradio u pet životinja koje su primile neku intervenciju, i uzeo odatle prosek; dobijam dva broja, koja poredim pomoću t-testa.

- ako se radi o poređenju više životinja nezavisno, ANOVA.

Kako i zašto, i da li ovde ima problema, to bi ti mogao da objasniš mnogo bolje nego ja.

E sad su stvari daleko jasnije. Naravno, morao sam da se nasalim, posto je izgledalo kao da sam procitao nesto na kineskom.

Na zalost, ni matematika nije moj fax (mada solidno poznajem neke oblasti), ovde bi od koristi daleko vise bio moj cimer, obzirom da se bavi finansijskom matematikom.

 

[gost 39034]

Ovo više vuče ka metodologiji Westerna nego ka problemima sa softverom. Ako rešiš osnovnu stvar, neće biti potrebna ni komplikovana statistika.

Prvo, background, čime blokiraš? Ja sam svojevremeno uspevao da značajno smanjim background korišćenjem 3-5% BSA (čista frakcija IV) umesto mleka. Takođe, očigledne stvari tipa smanjiti koncentraciju primarnog i/ili sekundarnog AB (u jednom slučaju, jedini reproducibilan rezultat sam mogao da dobijem sa količinom AB sto puta manjom od minimalne preporučene u literaturi).

Drugo, skenirani filmovi - čime skeniraš? Laserski skeneri mogu da rade, ali standardni skeneri unose ogromnu količinu varijacije (u zavinosti od položaja tačke na filmu u odnosu na izvor svetlosti, i u zavisnosti od lokalne varijacije kvaliteta u prijemniku).

Takođe, zašto koristiš filmove uopšte? Mislim, ok, za dokumentaciju, ali direktno merenje je odavno prešlo na druge metode, bar u mom domenu. Hemiluminiscencija se meri direktno, a aktivnost radioizotopa pomoću fosforescentnih listova koji se posle skeniraju laserom (Typhoon, Storm, i slične mašinice).

ne govorimo backgroundu samih blotova, naravno da podesim konc. Ab' i Ab'', kao i da uradim blokiranje, najcesce 3-5% mleko, retko BSA, primarno Ab u bloking solution, itd, itd, vec o background-u koji ti softver omogucava da eliminses tako sto ga odredis prema svojim filmovima ili samom blotu, ao je sa STORM-a..naravno da koristim STOR kad god mogu, ali na zalost, ovo je Srbija, jos uvek ne moze naruciti odgovarajuca fluoroscentna Ab, koliko god hoces i da rade ok sa svim primarnim, tako da nekada moramo da idemo na filmove...skeniram ih na obicnom skeneru, naravno...

 

[Paganko]

Predpostavljam da bi MATLAB posluzio u tu svrhu, obzirom da je prakticno moguce sve uraditi, ako se dobro isprogramira.

 

[Caliburn]

Predpostavljam da bi MATLAB posluzio u tu svrhu, obzirom da je prakticno moguce sve uraditi, ako se dobro isprogramira.

Mislim da ima i Toolbox za te stvari...

 

[endonuclease]

ne govorimo backgroundu samih blotova,
. . .
ali na zalost, ovo je Srbija, jos uvek ne moze naruciti odgovarajuca fluoroscentna Ab, koliko god hoces i da rade ok sa svim primarnim, tako da nekada moramo da idemo na filmove...skeniram ih na obicnom skeneru, naravno...

Ah, poštovanje za svakoga ko radi u naškim uslovima. Mi ovde na zapadu smo razmaženi...

Ali znam o čemu pričaš. Imam dva saveta.

Prvo, u korišćenju ImageQuant softvera, i oblik i veličina polja mora da bude savršeno jednaka. Dakle, probaj da ne radiš ono što se preporučuje - ne praviš polje koje je tačno veličine banda, već napravi jedno polje koje je dovoljno veliko za najveći/najsnažniji band. Onda lupiš copy, pa paste onoliko polja koliko ti treba. Onda ih odvučeš jedno po jedno preko svih bandova koje kvantifikuješ sa jednog filma, a onaj zadnji odvučeš preko praznog mesta na filmu (i njega koristiš kao background).

Iako će polja zahvatati značajan deo u okolini tanjih/manjih bandova, dobićeš daleko reproducibilnije rezultate nego inače. Ovo je, u stvari, jedini način na koga sam mogao da dobijem reproducibilne mere u DNA binding gelovima (i to sa fosforescentnim merenjima na Typhoon skeneru).

Drugo, proveri koliko buke unosi tvoj skener. Probaj da isti film skeniraš u različitim orjentacijama, i da te različite skenove kvantifikuješ i međusobno uporediš. Može se desiti da je tvoj skener dovoljno reproducibilan, ali može se desiti da je neupotrebljiv, što treba da znaš (u tom slučaju nema leka, moraš da tražiš neki drugi način skeniranja filmova).

 

[Paganko]

Mislim da ima i Toolbox za te stvari...

bioinformatics toolbox bese to sto sam danas instalirao sa ostatkom MATLAB-a.

 

[C2I3]

bioinformatics toolbox bese to sto sam danas instalirao sa ostatkom MATLAB-a.

What Is the Bioinformatics Toolbox?

The Bioinformatics Toolbox extends MATLAB to provide an integrated software environment for genome and proteome analysis. Together, MATLAB and the Bioinformatics Toolbox give scientists and engineers a set of computational tools to solve problems and build applications in drug discovery, genetic engineering, and biological research.You can use the basic bioinformatic functions provided with this toolbox to create more complex algorithms and applications. These robust and well tested functions are the functions that you would otherwise have to create yourself.Connecting to Web accessible databasesReading and converting between multiple data formatsDetermining statistical characteristics of dataManipulating and aligning sequencesModeling patterns in biological sequences using Hidden Markov Model (HMM) profilesReading, normalizing, and visualizing microarray dataCreating and manipulating phylogenetic tree dataInterfacing with other bioinformatic software (BioPearl and BioJava)The field of bioinformatics is rapidly growing and will become increasingly important as biology becomes a more analytical science. The Bioinformatics Toolbox provides an open environment that you can customize for development and deployment of the analytical tools you and scientists will need.Prototype and develop algorithms — Prototype new ideas in an open and extendable environment. Develop algorithms using efficient string processing and statistical functions, view the source code for existing functions, and use the code as a template for improving or creating your own functions. See Prototype and Development Environment.Visualize data — Visualize sequence alignments, gene expression data, phylogenetic trees, and protein structure analyses. See Data Visualization.Share and deploy applications — Use an interactive GUI builder to develop a custom graphical front end for your data analysis programs. Create stand-alone applications that run separate from MATLAB. See Algorithm Sharing and Application Deployment

 

[Caliburn]

Vidim da je MATLAB popularan.

Da li je neko koristio možda Toolbox za bioinformatiku?

 

[Paganko]

Ja nisam. Ali jesam Control System Toolbox, Simulink sa svim dodacima, itd....

Znam samo da ima odlican help za svaki modul pa i za BioInformaticsToolbox.

 

[Caliburn]

Ja nisam. Ali jesam Control System Toolbox, Simulink sa svim dodacima, itd....

Znam samo da ima odlican help za svaki modul pa i za BioInformaticsToolbox.

"Preaching to the choir."

Ja sam jednom počeo da pravim propagaciju pozitivne mutacije kroz generacije populacije, ali su me skolile obaveze, pa nisam dovršio.
To je sve moje iskustvo sa tim toolbox-om.
Nedavno sam video da postoje posebni programi za to ili tako nešto, tako da neću ni da se bakćem sa time.
Samo interesovalo nečije iskustvo, pošto na MathWorld-u umeju da budu veoma naporni.